STAGE MASTER 2 BIOLOGIE STRUCTURELLE 2024-2025 : Mesure de la translocation d’antibiotiques à travers les porines par résonance paramagnétique électronique

État de l’art :

La résistance bactérienne représente une menace croissante pour la santé humaine et animale dans le monde. En Europe, elle est responsable d’environ 25 000 décès par an ; et les coûts médicaux associés aux coûts sociaux qui en résultent sont estimés à environ 1,5 milliard d’euros par an. De nouvelles formes de résistance apparaissent et se propagent, laissant aux cliniciens peu d’options pour contrôler les infections. Dans le même temps, malgré la nécessité reconnue de développer de nouveaux composés antimicrobiens, la réalité est que seules deux nouvelles classes d’antibiotiques ont été introduites sur le marché au cours des trois dernières décennies. D’un point de vue scientifique, il est urgent de mieux comprendre le fonctionnement des antibiotiques, la manière dont la résistance se développe et les mécanismes moléculaires qui pourraient être exploités pour détourner la résistance bactérienne. Entre 2013 et 2018, le programme de recherche européen IMI-TRANSLOCATION visait à mieux comprendre le transport et l’accumulation des antibiotiques, ainsi que l’émergence de la multirésistance chez les bactéries Gram-négatives problématiques appartenant au groupe pathogène ESKAPE ( Enterococcus faecium , Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Enterobacter spp . Des résultats significatifs ont été obtenus concernant (i) la translocation des antibiotiques à travers les porines de la membrane externe, et (ii) l’impact des pompes à efflux sur l’accumulation et l’activité des antibiotiques chez les entérobactéries.

Rationnel :

L’efficacité des antibiotiques dépend de leur capacité à s’accumuler à l’intérieur des bactéries jusqu’à ce qu’ils atteignent une concentration seuil pour interagir avec leur(s) cible(s) et inhiber leur activité. Cependant, la membrane externe des bactéries à Gram négatif est très imperméable et les antibiotiques se diffusent à travers le canal étroit des porines. En même temps, ils constituent des substrats pour les pompes à efflux transmembranaires qui les expulsent1. En conséquence, de nombreux isolats cliniques présentant de multiples résistances aux antibiotiques présentent des modifications fonctionnelles ou une perte de porines, associées à une surproduction de pompes à efflux.

Les porines représentent une fraction substantielle du nombre total de protéines OM et favorisent la diffusion de solutés dont le poids moléculaire peut atteindre 600 Da. E. coli produit deux porines générales principales : OmpC et OmpF ¹ . Les canaux OmpF/C sont en forme de sablier, la partie la plus étroite étant appelée région de constriction (CR) en raison du pliage de la boucle L3. La boucle L3 génère également un fort champ électrique transversal à travers le CR, résultant d’une rangée de résidus chargés positivement sur la paroi du canon face à des résidus chargés négativement sur la boucle L3. Ce champ électrique a des conséquences directes sur la perméation moléculaire ² . Les structures de plusieurs orthologues OmpF/C ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Malgré des similitudes structurelles, les porines OmpC ont un rayon de pores plus petit, une conductance plus faible, une sélectivité cationique plus élevée et une intensité de champ électrique transversal plus faible. Des expériences prédisant la perméabilité et le gonflement des liposomes ont montré que la charge atomique et la taille des solutés constituent des limitations majeures à leur diffusion à travers les porines ³ . Nous avons récemment montré que la ceftazidime (CAZ), qui possède une charge nette négative, est active sur les bactéries exprimant les porines OmpF. En revanche, le céfépime zwitterionique (FEP) tue les bactéries quelle que soit la porine exprimée. La quantification des molécules accumulées par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) et des expériences sur des systèmes isolés ont confirmé que CAZ montre une préférence pour l’OmpF pour pénétrer dans les bactéries ⁴ .

La spécificité des porines vis-à-vis des antibiotiques est un enjeu important pour l’efficacité des antibiotiques et le développement de nouvelles molécules antibactériennes. Ici, nous visons à développer une approche utilisant la biochimie et la biophysique des protéines (spectroscopie de marquage de spin dirigé sur site (SDSL) et de résonance paramagnétique électronique (EPR)) pour mesurer les différences d’affinité entre les molécules antibactériennes et les porines. Les porines purifiées de K. aerogenes Omp35 et Omp36 seront reconstituées en liposomes selon un protocole privilégiant l’orientation « extérieur-extérieur ». Dans un premier temps, l’orientation de ces porines sera testée. Des substitutions de cystéine seront effectuées dans les boucles extra- et intracellulaires des deux porines. La fonctionnalité et la structure globale de tous les mutants seront analysées par des tests phénotypiques in vivo et par dichroïsme circulaire in vitro . Les protéoliposomes contenant ces variants reconstitués seront ensuite incubés avec un fluorophore spécifique de la cystéine et un extincteur de fluorescence imperméable à la membrane en l’absence ou en présence de détergent ⁵ . De même, l’extinction du signal EPR d’une protéine marquée avec un marqueur de spin nitroxyde sera étudiée en fonction de l’orientation de la protéine. Une analyse biophysique complète (taille, hétérogénéité) sera réalisée sur les protéoliposomes avant et après incorporation de la protéine marquée (sonde fluorescente ou sonde nitroxyde) par Dynamic Light Scattering (DLS).

La deuxième étape analysera les changements conformationnels potentiels des porines Omp35 et Omp36 en présence d’antibiotiques. À cette fin, nous avons sélectionné des acides aminés dans Omp35 et Omp36 situés au-dessus et en dessous du CR qui seront individuellement substitués par la cystéine pour un marquage avec une sonde nitroxyde. Tous les mutants ont été générés par mutagenèse dirigée sur site en utilisant les plasmides pColdIV- omp35 / 36 comme modèles et exprimés dans BL21Δ omp8 . Les niveaux d’expression des mutants et leur localisation correcte sur la membrane externe seront testés avant purification par chromatographie échangeuse d’ions (protocole MCT interne). Les mêmes mutations seront générées dans les plasmides pBAD24- omp35 / 36 pour confirmer qu’elles n’affectent pas la sensibilité aux antibiotiques chez E. coli K12. Les protéines mutantes Cys seront marquées avec une sonde nitroxyde et les spectres EPR seront analysés en l’absence et en présence d’antimicrobiens (FEP et CAZ). ^Des changements spectraux sont attendus si l’antibiotique entre en contact avec la sonde nitroxyde et établit des interactions favorables lui permettant de traverser la région de constriction et d’atteindre la sortie du ^canal 6-8 . Le résultat positif de ces expériences fournira un test in vitro rapide et puissant pour cribler toute une bibliothèque chimique d’antimicrobiens et déterminer la capacité de certaines molécules à pénétrer dans les porines des entérobactéries.

Les références :

1. Masi M, Réfrégiers M, Pos KM, Pagès JM. Mécanismes de perméabilité de l’enveloppe sur l’afflux et l’efflux d’antibiotiques chez les bactéries Gram-négatives. Nat Microbiol. 2017, 2:17001.
2. Vergalli J, Bodrenko I, Masi M, Moynie L, Acosta-Gutiérrez S, Naismith JH, Anne Davin-Régli, Ceccarelli M, van den Berg B, Winterhalter M, Pagès JM. Porines et translocation de petites molécules à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Nat Rev Microbiol. 2019, 18 : 164-76.
3. Acosta-Gutiérrez S, Ferrara L, Pathania M, Masi M, Wang J, Bodrenko I, Zahn M, Winterhalter M, Stavenger RA, Pagès JM, Naismith JH, van den Berg B, Page MGP, Ceccarelli M. Introduire des médicaments dans Gram -bactéries négatives : règles rationnelles de perméation à travers les porines générales. ACS Infect Dis. 2018, 4:1487-98.
4. Masi M, Vergalli J, Ghai I, Barba-Bon A, Schembri T, Nau WM, Lafitte D, Winterhalter M, Pagès JM. Translocation des céphalosporines à travers les canaux entérobactériens OmpF et OmpC, un filtre à travers la membrane externe. Commune Biol. 2022, 5:1059.
5. Deutschmann S, Rimle L, von Ballmoos C. Estimation rapide de l’orientation des protéines membranaires dans les liposomes. Chimiochimie. 2022, 23:e202100543.
6. Martinho M, Fournier E, Le Breton N, Mileo E, Belle V. Résonance paramagnétique électronique. La Société Royale de Chimie. 2018, 26 : -88.
7. Di Cesare M, Kaplan E, Rendon J, Gerbaud G, Valimehr S, Gobet A, Ngo TT, Chaptal V, Falson P, Martinho M, Dorlet P, Hanssen E, Jault JM, Orelle C. L’activité de transport de la multidrogue ABC le transporteur BmrA ne nécessite pas une large séparation des domaines de liaison aux nucléotides. J Biol Chem. 2024, 300:105546.
8. Bizet M, Byrne D, Biaso F, Gerbaud G, Etienne E, Briola G, Guigliarelli B, Urban P, Dorlet P, Kalai T, Truan G, Martinho M. Aperçu structurel de la forme semiquinone du cytochrome P450 réductase humain à distance DEER mesures entre une flavine native et un acide aminé non canonique marqué par spin. Chimie. 2024, 26:e202304307.