Etude du mécanisme de photoactivation de la protéine caroténoïde orange par cristallographie femtoseconde en série résolue dans le temps – UNIVERSITE GRENOBLE ALPES

Description

La protéine caroténoïde orange (OCP) est une protéine photoactive impliquée dans la photoprotection des cyanobactéries. Récemment, un mécanisme de photoactivation a été proposé, dans lequel l’état S2 initialement excité produit plusieurs états excités caractérisés par des durées de vie distinctes (ICT, S1, S*), mais aucune confirmation structurale n’a pu être apportée à ce jour. Un seul de ces états excités est le précurseur de l’état biologiquement actif de l’OCP, formé à l’échelle de la seconde. Afin de comprendre le mode d’action de l’OCP, nous proposons de la « filmer en pleine action », grâce à la cristallographie résolue en temps. Spécifiquement, nous proposons de caractériser les structures des états intermédiaires formés de l’échelle de la femtoseconde à la milliseconde, en réalisant une expérience de cristallographie résolue en temps ultra-courts. Cette expérience rééquerrera l’utilisation d’un laser à électrons libres (XFEL). Parallèlement, nous utiliserons la nouvelle ligne de lumière ID29 de l’ESRF, dédiée à la cristallographie résolue en temps, pour déterminer les structures des états intermédiaires se formant ultérieurement, de l’échelle de la milliseconde à la seconde. Notre projet de biologie structurale intégrée permettra de visualiser les changements conformationnels subis par l’OCP lors de sa photoactivation, de l’échelle photochimique (centaines de femtosecondes) à l’échelle photobiologique (secondes). Il ouvrira ainsi la voie à une compréhension détaillée du mécanisme de photoactivation et à l’exploitation de l’OCP en optogénétique ou comme « fusible moléculaire » dans les systèmes photosynthétiques biomimétiques.

Compétences requises

Nous chercherons à recruter un candidat ayant un intérêt marqué pour, et une formation solide en biologie structurale, ce qui facilitera l’acquisition des savoirs requis. Sa tâche principale consistera à déterminer la structure des différents intermédiaires réactionnels de l’OCP en utilisant à la fois la cristallographie conventionnelle (basée sur l’oscillation) et la cristallographie sérielle résolue en temps (TR), telle qu’implémentée dans les synchrotrons (TR-SSX) et les lasers à électrons libres à rayons X (XFEL ; TR-SFX). Le protocole de purification de l’OCP et ses conditions de cristallisation (pour former soit des macrocristaux adaptés à la cristallographie conventionnelle, soit des microcristaux adaptés à la cristallographie sérielle) étant déjà connus et utilisés dans notre laboratoire (Andreeva et al., 2022, Biophys J ; Wilson et al., 2022, BBA Bioenergetics), le candidat sera en mesure de procéder aux expériences de caractérisation spectroscopique et de piégeage d’intermédiaires par trempe rapide dès les premiers mois de la thèse. Ces données seront essentielles pour obtenir les temps de faisceau synchrotron et XFEL nécessaires à la conduite de nos expériences de TR-SSX et TR-SFX, respectivement. Nous envisageons que les premières collectes de données TR-SSX aient lieu dès la seconde moitié de la première année, et que la collecte de données TR-SFX se déroule au cours de la deuxième année de la thèse de doctorat (et au pire au cours de la première moitié de la troisième année). Après chaque collecte de données, l’étudiant.e traitera les données et déterminera la (les) structure(s) associée(s) en utilisant les méthodes d’extrapolation développées au laboratoire (De Zitter et al., 2022, Commun. Biol.). Elle/il construira le meilleur modèle décrivant les étapes de la réaction dans le processus d’extinction de l’OCP et testera les hypothèses mécanistes en générant des mutants OCP. Enfin, l’étudiant.e rédigera les résultats de ses études dans des publications de recherche. La/le candidat.e sera encouragé.e à commencer la thèse par une étude bibliographique et à suivre la littérature au cours du projet. Cela permettra non seulement de prendre des décisions correctes tout au long du projet, mais aussi de faciliter la rédaction des articles et de la thèse.

Bibliographie

Recent key publications of the IBS DYNAMOP group :
Barends TRM et al., 2024 Nature, 626, 905-911
Tetreau et al., 2022, Nature Commun, 13:4376
Sorigue et al., 2021, Science, 372: eabd5687
Tetreau et al., 2020, Nature Commun, 11:1153
Nass-Kovacs et al., 2019, Nature Commun, 10:3177
Coquelle et al., 2018, Nature Chem, 10, 31-37.
Tayeb-Fligelman et al., 2017, Science, 355:831-833.
Colletier et al., 2016, Nature, 539:43-47.

Mots clés

cristallographie résolue en temps, protéine carotenoid orange, quenching d’énergie, optogénétique